Factores impedientes in reactionibus PCR

Per reactionem PCR, nonnulli factores impedientes saepe occurrunt.
Propter altissimam PCR sensibilitatem, contaminatio habetur unus e factoribus gravissimis qui eventus PCR afficiunt et eventus falsos positivos producere potest.
Aeque magni momenti sunt variae origines quae ad falsos negativos eventus ducunt. Si una vel plures partes essentiales mixturae PCR vel ipsa reactio amplificationis inhibentur vel impediantur, experimentum diagnosticum impediri potest. Hoc ad efficaciam imminutam et etiam ad falsos negativos eventus ducere potest.
Praeter inhibitionem, amissio integritatis acidi nucleici scopi fieri potest propter condiciones transportationis et/vel repositionis ante praeparationem speciminis. Praesertim, temperaturae altae vel repositio insufficiens damnum cellularum et acidorum nucleicorum efficere possunt. Fixatio cellularum et textuum et inclusio paraffini causae notae fragmentationis DNA et problematis pertinacis sunt (vide Figuras 1 et 2). In his casibus, ne optima quidem isolatio et purificatio proderunt.

Figura 1 | Effectus immobilizationis in integritatem DNA
Electrophoresis in gel agarosi demonstravit qualitatem DNA ex sectionibus paraffinicis autopsiarum isolati valde variare. DNA fragmentorum longitudinum mediarum diversarum in extractis aderat, secundum modum fixationis. DNA conservatum est tantum cum fixatum est in exemplaribus congelatis nativis et in formalino neutro tamponato. Usus fixativi Bouin valde acidi vel formalini non tamponati, acidum formicum continentis, iacturam DNA significantem effecit. Fractio reliqua valde fragmentata est.
A sinistra, longitudo fragmentorum in paribus kilobasium (kbp) exprimitur.

Figura II | Integritatis amissio scoporum acidi nucleici
(a) Lacuna 3′-5′ in utroque filamento rupturam in DNA scopo efficiet. Synthesis DNA adhuc in fragmento parvo fiet. Attamen, si locus recoctionis primerorum in fragmento DNA deest, sola amplificatio linearis fit. In casu maxime opportuno, fragmenta se invicem resaturare possunt, sed proventus parvus erit et infra limites detectionis.
(b) Basium amissio, praecipue ob depurinationem et formationem dimerorum thymidini, ad diminutionem numeri vinculorum hydrogenii et diminutionem Tm ducit. Per elongatam phasim calefactionis, initiatores a DNA matrice liquefient nec etiam sub condicionibus minus strictis coalescent.
(c) Bases thyminae adiacentes dimerum TT formant.
Aliud problema commune quod saepe in diagnostica moleculari occurrit est emissio acidorum nucleicorum destinatorum minus quam optima comparata cum extractione phenolo-chloroformio. In casibus extremis, hoc cum falsis negativis coniungi potest. Multum temporis servari potest per lysis ebullientem vel digestionem enzymaticam reliquiarum cellularum, sed haec methodus saepe in sensibilitate PCR humili propter insufficientem emissionem acidorum nucleicorum efficit.

Inhibitio actionis polymerasis per amplificationem

In genere, inhibitio ut notio continens adhibetur ad describendos omnes factores qui ad eventus PCR suboptimales ducunt. Sensu stricte biochemico, inhibitio ad actionem enzymi limitatur, id est, conversionem substrati-producti per interactionem cum loco activo DNA polymerasis vel cofactoris eius (e.g., Mg2+ pro Taq DNA polymerasis) reducit vel impedit.
Partes in exemplo vel variae solutiones tampones et extracta reagentia continentia enzymum directe inhibere vel eius cofactores (exempli gratia EDTA) capere possunt, ita polymerasem inactivantes et vicissim ad eventus PCR imminutos vel falso negativos ducentes.
Multae tamen interactiones inter componentes reactionis et acida nucleica continentia scopum etiam "inhibitores PCR" appellantur. Postquam integritas cellulae per isolationem interrupta est et acidum nucleicum liberatum est, interactiones inter specimen et solutionem circumstantem necnon phasem solidam fieri possunt. Exempli gratia, "scaptores" DNA simplex vel duplex per interactiones non covalentes ligare possunt et isolationem et purificationem impedire, numerum scoporum qui tandem vas reactionis PCR attingunt reducendo.
In genere, inhibitores PCR in plerisque humoribus corporis et reagentibus ad probationes diagnosticas clinicas adhibitis (urea in urina, haemoglobina et heparina in sanguine), supplementis diaeteticis (componentibus organicis, glycogenum, adipe, iontibus Ca2+) et componentibus in ambitu (phenolis, metalla gravia) praesentes sunt.

Inhibitores PCR frequentiores inveniri possunt in bacteriis et cellulis eukaryoticis, DNA non destinato, macromoleculis DNA ligantes matricum textuum et apparatu laboratorium ut chirothecarum et materiarum plasticarum. Purificatio acidorum nucleicorum per vel post extractionem est methodus praeferenda ad removendos inhibitores PCR.
Hodie, varia instrumenta extractionis automatica multa protocolla manualia substituere possunt, sed recuperatio et/vel purificatio scoporum numquam perfecta est. Inhibitores potentiales adhuc praesentes esse possunt in acidis nucleicis purificatis vel iam effectum habuerunt. Variae rationes existunt ad vim inhibitorum minuendam. Electio polymerasis idoneae magnum impulsum in activitate inhibitorum habere potest. Aliae methodi probatae ad inhibitionem PCR minuendam sunt aucta concentratio polymerasis vel applicatio additivorum ut BSA.
Inhibitio reactionum PCR demonstrari potest per usum moderationis qualitatis processus interni (IPC).
Cura adhibenda est ut omnia reagentia et aliae solutiones in apparatu extractionis, ut ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol et phenol, ex isolato acidi nucleici per diligentem ablutionem removeantur. Pro concentratione earum, PCR vel activare vel inhibere possunt.